摘 要：蛋白酶是蛋白质消化和吸收的关键酶。在动物饲料中添加蛋白酶，可以提高动物对蛋白质的消化吸收，降低饲料中的抗营养因子，提高日增重，降低料肉比，降低营养性腹泻发生率，提高饲料利用率，改善动物生产性能。
关键词：蛋白质；蛋白酶；饲料利用率；生产性能
玉米-豆粕型日粮是我国应用较为普遍的一种动物饲料类型。豆粕中的蛋白质含量高达40%～50%，必需氨基酸组成平衡，接近理想蛋白质模式中的氨基酸比例，是最常用的植物性蛋白质饲料。然而，豆粕中含有大豆抗原蛋白、胰蛋白酶抑制剂等多种抗营养因子，显著降低动物对蛋白质的消化吸收[1]。玉米作为能量饲料的主要来源，蛋白质含量约为8.5%。玉米蛋白中氨基酸组成不均衡，赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸相对缺乏，且主要为淳溶蛋白。淳溶蛋白含有大量非极性疏水性氨基酸，在水中的溶解性较差，动物对其消化利用率不高[2]。动物对植物性蛋白质饲料的消化率一般仅为82%左右。
幼龄动物由于消化系统发育不成熟，自身分泌的蛋白酶不足以充分消化饲料中的蛋白质，影响生产性能的发挥，并造成原料的浪费。快速生长期的动物往往会配制高蛋白日粮，动物采食量大，自身分泌的蛋白酶与采食量不协调，蛋白质消化不彻底。未被消化或消化不完全的蛋白质经大肠微生物发酵会产生具有毒性的胺类物质，损伤肠壁，引发营养性腹泻。饲料中添加外源性蛋白酶，可以补充内源性蛋白酶的不足，提高动物对蛋白质的消化吸收，提高日增重，降低料肉比，降低营养性腹泻发生率，提高饲料的利用率，改善动物生产性能。
1 蛋白酶的分类
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶的总称。蛋白酶对作用底物具有严格的选择性，一种蛋白酶通常仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。蛋白酶的专一性和水解肽键的能力，不仅受切开点一侧或两侧相邻氨基酸残基的影响，甚至受离作用点间隔了若干单位的氨基酸残基的影响，也受肽键长度的影响。
蛋白酶有多种分类方法。依据来源不同，蛋白酶分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。动物蛋白酶主要是从猪、牛、羊等动物胰脏中提取获得，由于生产成本较高，动物饲料中很少使用。常见的植物蛋白酶有木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，他们分别从未成熟的番木瓜和菠萝中提取制得。木瓜蛋白酶是一种含巯基的内切型蛋白酶，具有蛋白酶和酯酶活性，有较广泛的底物特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等均具有较强的水解能力，可水解蛋白质和多肽链中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解在肽键的N端有2个羧基的氨基酸或含芳香环氨基酸的肽键[3]。木瓜蛋白酶分子量为21000，等电点为8.75，含212个氨基酸残基，由单一肽链组成，至少有3个氨基酸残基位于酶的活性中心，分别是Cys25、His159和Asp158。另有6个半胱氨酸残基形成3对链内二硫键，但都不在酶的活性中心。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，最适作用温度50℃～65℃，最适作用pH 6.0～7.0，耐热性强，在90℃时也不会完全失活，该酶广泛应用于啤酒及食品工业。菠萝蛋白酶主要存在于菠萝的茎和果实中，从菠萝的茎中提取的称为茎菠萝蛋白酶，从果实中提取的称为果菠萝蛋白酶。菠萝蛋白酶分子量为33000，等电点为9.55，含有285个氨基酸残基，活性中心含巯基，能分解蛋白质、多肽、酯和酰胺，水解蛋白质的能力比木瓜蛋白酶还要高10倍以上[4]。菠萝蛋白酶溶于水，不溶于一般的有机溶剂，最适作用温度55℃～60℃，65℃以上失活严重，最适作用pH6.5～7.5，pH7.1时活性达最大值，该酶主要应用于医药和食品行业。微生物蛋白酶由微生物发酵产生，细菌和真菌都能诱导分泌蛋白酶，发酵方式由固体发酵和液体发酵两种。
根据水解肽键的方式，蛋白酶分为内肽酶和外肽酶。内肽酶水解蛋白质分子内部的肽键，外肽酶水解蛋白质或多肽分子C端或N端的肽键。学术上一般按活性中心将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶四类[5]。丝氨酸蛋白酶是活性中心含有丝氨酸的蛋白水解酶，其活性中心都有一个Asp102-His57-Ser195催化三元组，最适作用pH9.5～10.5，属碱性蛋白酶，通过共价催化作用裂解特定的肽键。胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶等属于丝氨酸蛋白酶。金属蛋白酶的活性中心大多含Zn2+、Ca2+等二价金属离子，最适作用pH7.0～8.0，属中性蛋白酶。Zn2+直接参与断裂肽键，Ca2+主要稳定酶的分子构象。天冬氨酸蛋白酶的活性中心含有2个天冬氨酸残基，最适作用pH2.0～5.0，在酸性条件下稳定，主要通过酸碱催化作用裂解肽键。大多数天冬氨酸蛋白酶以酶原的形式合成，然后再被激活为具有生物学功能的活性形式。胃蛋白酶和凝乳酶属于典型的天冬氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶也叫巯基蛋白酶，其活性中心都含有Cys-His催化二分体，通常只在有还原剂（HCN或Cys）存在时才具有活性。木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶是此类蛋白酶的代表。
饲料中使用的蛋白酶主要是微生物蛋白酶，通常根据最适作用pH值，将其分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。酸性蛋白酶的最适作用pH2.5～4.0，最适作用温度40℃～50℃，黑曲霉3350和宇佐美曲霉537及其突变株是国内生产酸性蛋白酶的主要菌株。中性蛋白酶的最适作用pH6.5～7.5，最适作用温度45℃～55℃，枯草芽孢杆菌1398是其代表性发酵菌株。碱性蛋白酶的最适作用pH9.0～11.0，最适作用温度45℃～55℃，地衣芽孢杆菌2709是国内主要的产酶菌株。
2 蛋白酶是蛋白质消化吸收的关键酶
单胃动物对蛋白质的消化吸收主要依靠自身分泌的胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶等多种蛋白酶的共同水解作用。
胃蛋白酶是单胃动物胃内主要的消化酶，由胃蛋白酶原经盐酸激活而成。胃蛋白酶原由胃粘膜主细胞分泌。具有活性的胃蛋白酶又能自身激活胃蛋白酶原转变成胃蛋白酶。胃蛋白酶的最适作用pH1.5～2.5。胃液的强酸性使蛋白质变性，有利于蛋白质的水解。胃蛋白酶对肽键的特异性较差，主要水解由芳香族氨基酸及蛋氨酸和亮氨酸等形成的肽键。胃蛋白酶在酸性条件下稳定，但在中性条件下则会发生不可逆变性而丧失活性。蛋白质经胃蛋白酶作用后产物主要为多肽及少量的氨基酸。
饲料中的蛋白质在单胃动物胃内的消化很不完全，小肠是蛋白质消化吸收的主要场所。在小肠中，未经消化或消化不完全的蛋白质受胰液及肠粘膜细胞上的多种蛋白酶及二肽酶的共同作用，进一步水解成寡肽和氨基酸。胰液中的蛋白酶有内肽酶和外肽酶两种。内肽酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶，它们对不同氨基酸组成的肽键有一定的专一性。胰蛋白酶的最适作用pH8.0，水解由碱性氨基酸的羧基组成的肽键；糜蛋白酶的最适作用pH8.0，水解由芳香族氨基酸的羧基组成的肽键；弹性蛋白酶的最适作用pH7.8，主要水解由脂肪族氨基酸的羧基组成的肽键。胰蛋白酶对天然蛋白质的水解作用较小，但对经胃酸消化而变性的蛋白质则作用迅速。胰液中的外肽酶主要是羧基肽酶，它们从肽链的羧基末端开始，每次水解脱去一个氨基酸。羧基肽酶A水解除脯氨酸、精氨酸、赖氨酸以外的多种氨基酸组成的羧基末端肽键，羧基肽酶B水解由碱性氨基酸组成的羧基末端肽键。胰液中的蛋白酶无论是内肽酶还是外肽酶，都以酶原的形式由胰腺细胞分泌。进入十二指肠后胰蛋白酶首先被肠激酶激活。胰蛋白酶又将糜蛋白酶原、弹性蛋白酶原和羧基肽酶原激活。胰蛋白酶也有较弱的自身激活作用。
蛋白质经胃和胰液中的蛋白酶的消化后产物中约1/3为氨基酸，2/3为寡肽。寡肽的水解主要在小肠粘膜细胞内进行。小肠粘膜细胞刷状缘存在两种寡肽酶，即氨基肽酶和二肽酶。氨基肽酶从氨基末端逐个水解出游离氨基酸。二肽经二肽酶水解最终生成氨基酸。蛋白质被蛋白酶消化分解成氨基酸或小肽后被肠粘膜直接吸收进入血液循环供机体利用。
3 蛋白酶在动物饲料中的应用
在饲料中添加外源性蛋白酶，可以有效补充内源性蛋白酶的不足，增强内源性蛋白酶的活性；某些外源蛋白酶可能因作用位点等方面的不同，将一些动物内源酶难以消化的蛋白质水解为肽和氨基酸；降低饲料中的抗营养因子；提高蛋白质的消化利用率，提高日增重，降低料肉比，改善动物生产性能[6-7]。目前饲料中使用的蛋白酶主要是酸性蛋白酶。费笛波等[8]在仔猪饲料中添加0.1%的酸性蛋白酶，发现日增重和饲料转化率分别提高7.77%和4.71%。祝国强等[9]用含0.1%的酸性蛋白酶饲料饲喂早期断奶仔猪，结果表明平均日增重提高11.94%，饲料转化率提高15.18%。吴天星等[10]研究发现，酸性蛋白酶能提高仔猪的蛋白质表观消化率，降低腹泻发生率，促进小肽、氨基酸的吸收。张耕等[11]在断奶仔猪日粮中添加外源性蛋白酶，结果发现外源性蛋白酶能显著改善仔猪断奶后消化不良，减轻断奶应激对仔猪的影响。郭建来等[12]研究发现，添加0.1%的酸性蛋白酶可以显著提高仔猪的生长性能，显著降低腹泻率。李建沅[13]等研究了蛋白酶对鲁烟白猪养分消化率及氮平衡的影响，发现蛋白酶在玉米-豆粕型、玉米杂粕型和小麦杂粕型饲粮中对鲁烟白猪粗蛋白质消化率分别提高了1.19%、3.63%和1.91%，氮总利用率分别提高了1.21%、1.97%和0.92%。Simbaya等[14]报道在使用双低菜粕的肉仔鸡日粮中添加蛋白酶，无论是高蛋白配方还是低蛋白配方，肉鸡的生长性能都可以得到改善。Yu等[15]研究也证实，在玉米-豆粕型日粮中添加蛋白酶，可以提高肉鸡的生长性能，改善饲料转化率。李东东等[16]研究了不同粗蛋白水平饲粮添加外源蛋白酶对肉鸡生产性能、血清生化指标和抗氧化功能的影响，结果表明饲粮粗蛋白水平降低1%后添加300mg/kg蛋白酶对肉鸡生产性能、血清生化指标和抗氧化功能无影响。
大豆抗原蛋白是豆粕中最主要的抗营养因子，也是引起断奶仔猪腹泻的主要原因。大豆抗原蛋白热稳定性强，即使经过加热处理仍能保留较强的免疫原性。幼龄动物采食含大豆抗原蛋白的日粮后，大部分大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白被降解为寡肽和氨基酸。然而，由于肠道粘膜发育不成熟，仍有一小部分以完整的大分子形式穿过小肠上皮细胞间或上皮细胞空隙内完整地进入血液和淋巴，这些具有抗原活性的大分子物质会刺激机体产生免疫反应，并表现为过敏性腹泻症状。胥九兵等[17]研究表明，蛋白酶可减轻豆粕中抗营养因子的影响，提高豆粕的营养价值。胰蛋白酶抑制剂是一种多肽或简单的蛋白质，它可作为底物被蛋白酶水解，使其结构发生改变而失活。Caine等[18]报道，用蛋白酶处理豆粕可以降低豆粕中胰蛋白酶抑制剂的含量。
4 蛋白酶应用存在的问题及展望
蛋白酶的开发和应用是目前酶制剂研究的热点。饲料中使用的蛋白酶主要以酸性蛋白酶为主。这主要是因为酸性蛋白酶具有良好的耐酸性能，在动物胃内可以补充胃蛋白酶的不足并协助胃蛋白酶消化蛋白质。中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适作用pH6.5～10.5，胃内的强酸环境对中性蛋白酶和碱性蛋白酶的活力破坏严重，大大降低了中性蛋白酶和碱性蛋白酶在饲料中的应用效果。市售酸性蛋白酶主要有537酸性蛋白酶和黑曲酶酸性蛋白酶两种。537酸性蛋白酶主要应用于皮毛、制革行业，在饲料工业应用较少。饲料中普遍使用的是由黑曲霉发酵生产的酸性蛋白酶，该酶通过固体发酵工艺生产比液体发酵产酶活力更高。酸性蛋白酶作为胃蛋白酶的补充仅能在胃内酸性条件下对蛋白质进行初步消化。然而，蛋白质消化吸收的主要场所在小肠，依靠的主要是胰蛋白酶和糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶的深度水解作用，因此中性蛋白酶和碱性蛋白酶对蛋白质的消化吸收具有更加重要的作用。寻找耐酸性能良好的中性蛋白酶和碱性蛋白酶将是今后蛋白酶研究开发的重要方向。酶的本质是蛋白质，蛋白质对热敏感。饲料制粒高温对蛋白酶的活力破坏严重，如何提高蛋白酶的耐制粒高温性能依然是研发的难点。玉米蛋白中的醇溶蛋白消化率不高，大豆抗原蛋白的抗营养作用显著，研究和开发能提高玉米醇溶蛋白和大豆抗原蛋白消化利用率的蛋白酶产品，对节约饲料资源、降低饲料成本将具有重要的现实意义。
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